*
*

*

Msống đầu Vào trong năm 1970, cách thức giải trình từ ADoanh Nghiệp bằng chuỗi tổng đúng theo hoặc nghệ thuật bóc tách các đoạn ADN đã được Sanger và tập sự sáng tạo. Phương thơm pháp này thuận lợi tự động hóa, không dùng các chất độc hại đề nghị được sử dụng thịnh hành cho giải trình từ ADN từ những năm 1980 mang đến đến ni. Trình tự cỗ ren người thứ nhất đã có giải thuật bởi cách thức Sanger vào năm 2004 với sự hợp tác của 15 quốc gia vị Mỹ đứng đầu, đã tiêu tốn rất các thời gian cùng nguồn lực. câu hỏi cần giải đáp được đặt ra là, làm thế nào để có thể rút ngắn thời gian và giảm đưa ra phí giải trình tự toàn cục hệ ren. Với nguyên nhân này, Viện Nghiên cứu vớt hệ gen tín đồ nước nhà (NHGRI - Hoa Kỳ) đã khởi cồn công tác chi tiêu cùng với mục tiêu làm sút chi phí giải thuật hệ gene bạn xuống 1.000 USD trong 10 năm. Đây là động lực tác động sự trở nên tân tiến cùng thương mại hóa những technology NGS. Các phương pháp giải trình tự này có 3 Điểm sáng cách tân chính: nhờ vào thư viện NGS mà ko yêu cầu nhân dòng những đoạn ADoanh Nghiệp, hàng ngàn cho đến hàng triệu phản bội ứng giải trình trường đoản cú được thực hiện đồng thời, hiệu quả giải trình trường đoản cú được khẳng định thẳng ko phải trải qua năng lượng điện di. Dưới phía trên là tóm tắt một số công nghệ NGS đã được ứng dụng rộng rãi hiện nay. Một số technology NGS Công nghệ giải trình tự pyrosequencing 454 Pyrosequencing 454 do 2 bên công nghệ Nyren với Ronaghi của Viện Kỹ thuật Stockholm (Thụy Điển) phát minc, và được tiến lên bởi công ty chúng tôi 454 Life Science, là 1 trong khối hệ thống giải trình trường đoản cú ADoanh Nghiệp 2 bước có độ tương đương cao cùng với dung lượng to hơn không hề ít đối với khối hệ thống giải trình tự Sanger. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc “giải trình tự bởi tổng hợp” bao gồm: khởi hễ một tua ADN đã có được giải trình trường đoản cú cùng giải trình trường đoản cú tua bổ sung cập nhật bằng làm phản ứng của enzyme. Đây là khối hệ thống có thể khuếch tán một số trong những lượng lớn các đoạn ADoanh Nghiệp trong số giếng picotiter. Nguyên lý “giải trình từ bởi câu hỏi tổng hợp” cũng dựa vào câu hỏi phân biệt các pyrophosphate (PPi) được giải pchờ trong quá trình đính nucleotide, tạo thành một biểu thị tia nắng, kết quả hơn chuyên môn chấm dứt chuỗi bởi dideoxynucleotide. Công nghệ pyrosequencing gồm tính linc hoạt cao khi link cặp primer, có khả năng so với được rất nhiều tự dưng đổi thay, tài liệu cùng báo cáo trình từ tập hòa hợp được đầy đủ. Kỹ thuật này có tính nhạy cảm cao hơn nhiều so với phương thức truyền thống lâu đời, độ đúng đắn lên tới mức 99,9% với những đoạn 200 base cùng 99% cùng với các đoạn 400 base. Hệ thống giải trình trường đoản cú được 400-600 triệu bp trong vòng 10 giờ đồng hồ, giúp áp dụng chính sách ưu đãi giảm giá thành đáng chú ý đối với Khi áp dụng phương pháp Sanger để giải trình từ bỏ một vài lượng béo ADoanh Nghiệp. Công nghệ này với các chuyên môn giải trình từ bỏ thế hệ mới khác có tương đối nhiều tác động đến vận động nghiên cứu gồm lượng tài liệu đầu vào phệ, và trải đời cách xử lý vào thời gian nlắp, nhờ vào này đã tạo ra nhiều cải tiến vượt bậc trong số lĩnh vực: công nghệ sinh học, sinh học pháp y, khối hệ thống học tập cùng y học tập.

Bạn đang xem: Next generation sequencing là gì, công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới


*

Hình 1: sơ đồ tổng quát quy trình giải trình tự ADoanh Nghiệp bằng NGS. 1. Chuẩn bị mẫu: ADN được cắt thành các đoạn nhỏ có kích thcầu từ 200 đến 500 bp, gắn adapter phù hợp; 2. Các đoạn ADN sau thời điểm gắn adapter được tiến hành làm giàu bằng PCR (Polymerase chain reaction) trong môi trường dung dịch (emulsion PCR) đối với công nghệ giải trình tự trên máy phát âm trình tự 454 của Roche và máy phát âm trình tự SOLiD của Life Technologies hoặc PCR bắc mong (bridge PCR) theo công nghệ Solexa của Illumina; 3. Đọc trình tự các đoạn ADoanh Nghiệp đã được làm giàu bằng các công nghệ tương ứng


Công nghệ giải trình từ bởi tổng thích hợp SBS sử dụng 4 nucleotide đánh dấu huỳnh quang đãng để giải trình từ hàng chục triệu cluster mặt khác bên trên mặt phẳng flow-cell. Trong mỗi quy trình giải trình từ, một deoxynucloside triphosphate đánh dấu (dNTP) được cung ứng chuỗi acid nucleic. Nhãn huỳnh quang của nucleotide nhập vai trò nhỏng một khóa ngừng phản bội ứng polymer hóa, cho nên vì vậy sau thời điểm từng dNTP được tích phù hợp, dye huỳnh quang được đánh dấu nhằm xác định nucleotide cùng kế tiếp bị giảm bỏ nhằm tổng đúng theo nucleotide tiếp theo. Vì cả 4 nhiều loại dNTPhường. đính khóa dừng tổng đúng theo thuận nghịch xuất hiện đôi khi dưới dạng 1-1 phân tử, sự đối đầu bất chợt giúp giảm thiểu câu hỏi tổng đúng theo mất cân đối. Việc xác định các base nhờ vào độ mạnh bộc lộ đo được trong những chu trình, giúp giảm tphát âm những không đúng số thô so với technology khác. Kết trái sau cùng là trình từ được gọi từng base một với độ đúng đắn cao, loại bỏ được các lỗi vì chưng tính chất trình từ, chất nhận được quy trình giải trình trường đoản cú trẻ trung và tràn trề sức khỏe trên cục bộ genome, bao gồm những trình tự lặp lại.
Phương pháp giải trình trường đoản cú SBS có công dụng xử trí bên cạnh đó con số cực to những đoạn nên đọc trình tự cùng với độ bao trùm đồng nhất, góp tác dụng xác minh biến tấu di truyền bao gồm độ tin cậy cao. Khối lượng chủng loại phệ cho phép thực hiện các pháp luật những thống kê cùng mang lại điểm, tương tự như nhỏng những phương thức truyền thống vào bài toán xác minh thể đồng hòa hợp, dị thích hợp cùng sáng tỏ các lỗi giải trình từ bỏ. Cụ thể, từng base đọc thô có một điểm số chất lượng giúp ứng dụng hoàn toàn có thể xác minh sự không nên khác cùng mang đến điểm số tin tưởng.
Công nghệ giải trình tự SBS là quá trình một chiều, mang tính chất tự động hóa cao, thưởng thức thời gian cùng thao tác làm việc tối thiểu. Với kỹ năng tạo ra hàng Gb dữ liệu ADoanh Nghiệp trong một đợt chạy, tức thì cả những genome Khủng của những động vật gồm vú cũng hoàn toàn có thể giải trình từ trong một vài tuần ráng vị một vài ba năm như trước cơ.
Công nghệ giải trình tự SOLiD có phong cách thiết kế dựa vào nguyên lý ghnghiền nối, tổng thể genome được bổ thành những đoạn ADoanh Nghiệp ngắn, tiếp nối từng đoạn được lắp với những adapter rồi cố định và thắt chặt vào những phân tử trường đoản cú. Quá trình giải trình từ bỏ được tiến hành thông qua những oligonucleotide được ghi lại huỳnh quang quẻ. Thứ nhất các primer được ghép cặp thông qua links bổ sung cập nhật cùng với những đoạn adapter, quy trình tổng vừa lòng được triển khai như sau: 4 các loại oligonucleotide (từng đoạn tất cả 8 base) gồm khắc ghi huỳnh quang đãng được đã nhập vào các vị trí tiếp sau ban đầu tự địa chỉ 5’Phường. của mồi. Sau từng một lượt gắn của những đoạn oligonucleotide thì một dấu hiệu huỳnh quang quẻ được ghi thừa nhận, kế tiếp dựa vào hoạt tính của enzyme, các nucleotide ban đầu từ bỏ số 6 bị nockout ra, kèm theo đó nhãn huỳnh quang được đào thải nhằm lòi ra địa điểm 5’Phường, quy trình đính thêm được liên tục tiến hành cho tới hết chiều lâu năm của đoạn ADoanh Nghiệp. Kết thúc quá trình đầu tiên, một primer new tiếp tục được gắn với tua khuôn tại phần tịnh tiến 1 nucleotide về phía đằng trước so với vị trí đính của primer trước tiên với liên tiếp quá trình thu nhấn biểu đạt thông qua các phản nghịch ứng ghxay nối. Quá trình được lặp lại 5 lần, mỗi lần sử dụng một mồi mới với tịnh tiến 1 nucleotide về vùng trước đối với địa điểm đính mồi trước kia.
Dữ liệu xuất ra của hệ thống rất có thể lên đến 60 Gb với mức hơn 1 tỷ đoạn được gọi sau từng lượt chạy. Kích thước với độ tin yêu của từng đoạn ADN được Đánh Giá là tương đương đối với khối hệ thống của Illumina, trong những lúc đó ngân sách thứ của technology SOLiD thấp hơn đáng kể đối với các hệ thống khác cùng rứa hệ.

Công nghệ giải trình tự Nanoball sequencing Nanoball sequencing là một trong công nghệ mới, tiên tiến và phát triển, được áp dụng để giải trình từ bỏ toàn thể hệ ren của một sinch đồ dựa vào quy trình xào luộc của vi trùng. Các đoạn ADoanh Nghiệp được khuếch đại rồi cuộn lại thành các nanoball. Quá trình giải trình trường đoản cú trải qua chuyên môn nanoball bao gồm có: i) Tinc sạch ADN tổng, tiếp kia sử dụng enzyme nhằm biến bọn chúng thành các đoạn ADoanh Nghiệp gồm form size trường đoản cú 400 mang đến 500 bp, sau đó lắp adapter vào những đoạn ADN, rồi cuộn bọn chúng lại thành các nanoball; ii) Các đoạn ADoanh Nghiệp được xào nấu theo vẻ ngoài coppy ADN dạng vòng của vi khuẩn, tiếp đến những nanoball được chuyển lên một flow cell bao gồm chứa những mẫu mã dò tất cả gắn huỳnh quang đãng rồi đính cùng với những trình từ nucleotide sệt hiệu; iii) Tín hiệu huỳnh quang quẻ chiếm được trên mỗi điểm quánh hiệu được đánh dấu thông sang 1 đồ vật hình ảnh gồm độ sắc nét cao với được so sánh trải qua những phương tiện phân tích tin sinch học tập. Cuối cùng, các dữ liệu về gen được đối chiếu, thêm ráp và xác định trình từ.

Công nghệ giải trình tự SMRT (Single Molecular Real-Time) SMRT là technology giải trình tự tiên tiến tuyệt nhất bây chừ. Nếu tất cả những technology giải trình trường đoản cú nêu trên đầy đủ dựa vào cách thức cơ bạn dạng bởi vì Sanger sáng tạo ra năm 1977, Gọi là “cách thức cách quãng chuỗi” (chain-termination method), thì SMRT xác định trình trường đoản cú ADoanh Nghiệp theo một bí quyết tương đối khác: nó “quan lại sát” quy trình tổng hòa hợp một chuỗi ADN tự nhiên và thoải mái bởi ADN polymerase đơn nhất, các biểu đạt từ nucleotide được đánh dấu phosphate sẽ được phân phát hiện tại theo thời gian thực giúp xác định đúng chuẩn nucleotide như thế nào trong 4 nhiều loại nucleotide đang được đã tích hợp mạch, cho nên vì thế lúc đoạn ADN được coppy kết thúc thì máy cũng khẳng định kết thúc trình từ bỏ đoạn ADN đó. Công nghệ này vô cùng hữu ích đến các ứng dụng giải trình tự nhiều loại hệ gene của các sinch vật không có lên tiếng về hệ gene (de novo genome sequencing).

Xem thêm: Hướng Dẫn Đổi Năm Sinh Trên Facebook Quá Số Lần, Làm Cách Nào Để Thay Đổi Ngày Sinh Của Tôi Và

Các hướng áp dụng NGS


Giải trình từ bỏ toàn thể hệ gene (Whole genome sequencing - WGS) với giải trình tự hệ gen biểu hiện (Whole exome sequencing - WES) là 2 xu hướng chính vận dụng công nghệ NGS vào giải trình tự ADoanh Nghiệp. WGS/WES được cho phép tìm kiếm kiếm với khẳng định các biến dạng DT SNPhường, InDel, CNV, SV... có trong cá thể, quần thể so với số đông loài đã bao gồm hệ gene tham chiếu. Việc vạc hiện nay những biến dị di truyền giúp phân phát hiện nay các biến dị gây nên căn bệnh di truyền đã biết, từ kia thực hiện lựa chọn ung thư/căn bệnh di truyền nhanh chóng hoặc theo dõi đáp ứng nhu cầu điều trị; cung ứng các biến dị mang lại phân tích GWAS, chú giải...; đánh giá nhiều mẫu mã quần thể bằng phương pháp khẳng định tần số allen...
Những điểm mạnh quá trội về năng suất và Chi tiêu đã khiến cho WGS biến chuyển cách thức phù hợp độc nhất mang đến các mục tiêu nghiên cứu. WGS càng ngày càng được áp dụng nhiều hơn thế nữa cho những nghiên cứu và phân tích giải thuật nhỏng khoa học pháp y, di truyền nông nghiệp trồng trọt cùng các chẩn đân oán lâm sàng (chẩn đân oán căn bệnh di truyền là 1 trong những ví dụ). trong số những vận dụng lâm sàng đặc biệt khác là giải trình trường đoản cú các chủng tạo căn bệnh cùng các dịch truyền lây lan quyên tâm.
Đối với khá nhiều vận dụng, việc giải trình trường đoản cú toàn cục hệ gene là không thực tế với không cần thiết. Do đó, giải trình tự hệ ren biểu lộ (WES) là phương án tiếp cận phù hợp đối với hầu như vùng gene quyên tâm, ví dụ Exon chỉ chiếm khoảng chừng 2% vào hệ gene người tuy thế thay đổi trong những số đó lại tạo ra 85% những cnạp năng lượng dịch đang biết. Vì lý do này, WES đã có thực hiện đến nghiên cứu và phân tích lâm sàng Một trong những năm gần đây, đã tạo ra nhiều lao lý chẩn đân oán có tương lai đang làm cho chuyển đổi đáng chú ý các dịch vụ y tế và chăm lo sức khỏe.
Một phía tiếp cận cao hơn nữa new cải cách và phát triển trong thời gian cách đây không lâu là giải trình từ bỏ các gene quan tâm đã có khuếch tán bởi PCR. Pmùi hương pháp này cân xứng với các kiểm soát dịch, tập trung vào một trong những lượng giới hạn những căn bệnh bao gồm tương quan đến các biến chuyển thể hoặc ứng dụng trong giải trình tự ren 16S của rARN trường đoản cú các loài khác biệt. Đây là phương thức được sử dụng thoáng rộng trong khối hệ thống học và tạo ra chủng loại, rõ ràng là thân các chủng loại đa dạng chủng loại về DT. Phương thơm pháp này dùng làm dánh giá sự phong phú của vi trùng trong môi trường, góp những công ty nghiên cứu so với được hệ vi sinch đồ vật từ những chủng loại cạnh tranh hoặc tất yêu nghiên cứu và phân tích được.
Các phiên bản phiên mã của sinh vật dụng nhân chuẩn chỉnh khôn cùng phức hợp cùng các ren tạo ra các phiên bản đối mã. Trên cơ sở những công nghệ NGS, nhiều quy trình quánh hiệu cho ARN-seq đã có cải tiến và phát triển, tiến trình thứ nhất mở ra năm 2008. Các quá trình này được cho phép xác định các phiên bản đối mã điều hòa có thể vào vai trò quan trọng đặc biệt trong số tính năng sinc học tập. Phân tích những bạn dạng phiên mã bây giờ cũng rất có thể triển khai được ở tại mức độ các tế bào đơn nhất dựa trên những cách thức chuẩn bị mẫu đã có cách tân. Phân tích tổng thể các phiên bản phiên mã của các tế bào riêng lẻ sẽ cho thấy thêm rất có thể có những phiên bản phiên mã ko hoàn toàn tương đương nhau giữa các tế bào giống nhau. Một phương pháp new được chào làng năm năm trước mang tên là giải trình tự ARN huỳnh quang quẻ trên địa điểm (FISSEQ), có thể phân tích về toàn thể những phiên bản phiên mã của những tế bào đơn nhất, bên cạnh đó xác minh được vị trí đúng chuẩn của từng phiên bản phiên mã vào tế bào.
Hạn chế của phương thức ARN-seq truyền thống là vấn đề xác định cường độ định hình của ARN ko phản ánh được chuyển động phiên mã hoặc tốc độ sinc tổng thích hợp protein. Vài năm ngoái đây, cách thức NET-seq Thành lập góp bọn họ chú ý được các phiên bản phiên mã ở độ phân giải từng nucleotide trải qua giải trình từ quánh hiệu từng phiên bản sao mới được tạo nên. Phương pháp này dựa vào kết tủa miễn kháng của ARN polymerase kết hợp với giải trình từ đầu 3’ của các ARNs new tổng đúng theo được đồng kết tủa. NET-seq là phương thức thay thế sửa chữa đến ARNP.. ChIP-seq với độ phân giải cao hơn và lưu giữ biết tin về mạch ARN.
Một phương thức khác là ribo-seq đã được áp dụng để xác minh bạn dạng thứ dịch mã ribosome bên trên ARN thông báo, phương pháp này phối kết hợp thân dấu tích của nuclease cùng giải trình từ 28-30 nucleotide vào vùng được đảm bảo an toàn cùng với ribosome của phiên bản phiên mã. Kỹ thuật này được áp dụng trong số nghiên cứu về ổn định dịch mã của ren cùng vẻ ngoài sinc tổng hòa hợp protein.
Nhìn chung, sự lộ diện của NGS đang được cho phép các đơn vị kỹ thuật phân tích về những khối hệ thống sinh học ở tầm mức độ trước đó chưa từng giành được tự trước tới thời điểm này. Cùng với việc cải tiến và phát triển của technology, những cách tiến hành sẵn sàng chủng loại cùng hình thức đối chiếu dữ liệu cũng được bức tốc trẻ khỏe. Do đó, NGS đang trở thành technology cơ bản vào nghiên cứu cơ phiên bản và mau lẹ trsống thành công nuốm mang đến các nghiên cứu và phân tích về di truyền học và các nghiên cứu tương quan khác. Với sự tiến nhanh mạnh về công nghệ, giữa những năm sắp tới đây, sẽ có được sản phẩm triệu bộ gen bạn được giải thuật, tạo ra bộ dữ liệu ren mập mạp so với phần đông gì đang sẵn có. Vì vậy, vấn đề đạo đức cần phải quan trọng quan tâm, đôi khi buộc phải đưa ra mọi cách thức công dụng trong việc lưu trữ với so với tài liệu lúc tốc độ dữ liệu được tạo nên ngày dần Khủng.
Bài viết liên quan

Trả lời

Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *